電洗脫法基本原理和實(shí)驗(yàn)方法

電洗脫法基本原理

將電泳分離后含目的DNA片段的瓊脂糖切割下來(lái)， 裝于透析袋中，繼續(xù)在高電壓下電泳，這時(shí)目的DNA會(huì)從凝膠中電泳出進(jìn)入透析袋中， 由于DNA分子量大，不能透過(guò)透析袋，從而保留于透析袋中。取出透析袋中含DNA的溶液， 進(jìn)一步用酚、氯仿抽提純化。

電洗脫法實(shí)驗(yàn)方法

（一）透析袋的處理：

1．切取適當(dāng)長(zhǎng)度適析袋。

2．在２％NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸10分鐘。

3．棄去煮沸液，加無(wú)菌水內(nèi)外反復(fù)洗凈透析袋。

（二）電洗脫

1．在長(zhǎng)波紫外燈下（300－360nm ）將含目標(biāo)DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中。

2．向透析袋內(nèi)加入２ml電泳緩沖液，使之浸沒(méi)凝膠，并排空汽泡。

3．將透析袋水平放入電泳槽（長(zhǎng)度方向與電泳平行）， 加入適量緩沖液將透析袋浸沒(méi)（約６－７mm）。

4．接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠。

5．改變電場(chǎng)方向繼續(xù)通電1分鐘。

6．從透析袋中吸出緩沖液于1－5ml Eppendorf管中。

7．加入1.5倍體積正丁醇，混勻抽提去EB。

8．在臺(tái)式離心機(jī)上高速2分鐘。

9．吸去上層，正丁醇溶液。

10．重復(fù)7，8，9二次。

11．自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿（２個(gè)）抽提２次。

12．上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc ２倍體積預(yù)冷無(wú)水乙醇，于20℃過(guò)夜。

13．12000g，4℃下離心10分鐘，得DNA沉淀。

14．棄上清，加入70％乙醇洗滌２次后棄干乙醇。

15．加入50μl TE溶解DNA。

16．取10μl DNA溶液加入2μl Loading buffer于0.8％瓊脂糖上， 40伏電泳，3小時(shí)。

17．在紫外透射儀上觀察結(jié)果。

18．測(cè)定DNA溶液OD260,OD280值。

結(jié)果與分析

1．計(jì)算DNA回收效率，判斷DNA純度。

2．記錄電泳結(jié)果

從瓊脂糖凝膠（Agaros gel）中回收DNA片段實(shí)驗(yàn)步驟

1. 配制TAE電泳緩沖液(10′儲(chǔ)存液)，10′加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)。

2. 操作步驟

1) 用1′TAE配制1%瓊脂糖凝膠。DNA用合適的酶切。

2) 在膠上選定兩個(gè)加樣孔，分別加入少量(10μl)和大量(50μl )DNA酶切產(chǎn)物，電泳。

3) 電泳結(jié)束后用刀片切下含有少量DNA酶切產(chǎn)物的泳道(一般選擇位于凝膠的邊緣)，在紫外燈下找到目的DNA 帶，用刀片切在帶的下上下邊緣各切一個(gè)小口作為標(biāo)記。注意：含有大量DNA酶切產(chǎn)物的凝膠既不用加熒光染料，也不用紫外燈照射！

4) 將做好標(biāo)記的凝膠條與未染色的凝膠原位對(duì)齊，根據(jù)小膠條上的標(biāo)記估計(jì)未染色的大膠上DNA酶切產(chǎn)物的位置，用刀片切下大膠中DNA產(chǎn)物所在的凝膠(盡量不要多余的凝膠)，轉(zhuǎn)移至一個(gè)稱(chēng)量過(guò)的干凈的1.5ml微量離心管中。再稱(chēng)量后計(jì)算出膠的重量。

5) 按照DNA快速純化/回收試劑盒操作說(shuō)明，純化回收目的片段。